iISM ja merkitsemätön solukuvaus: uudet näkymät soluissa

Kuvittele seisovasi pienen työpajan kynnyksellä, jossa molekyylikoneet kolahtavat, järjestäytyvät uudelleen ja reagoivat. Et voi koskea niihin. Et voi merkitä niitä. Silti toiminta on läsnä, tapahtuu reaaliajassa. Tämä on Stanfordin ryhmän uusi lupaus: he ovat yhdistäneet kaksi kuvantamistraditiota paljastaakseen eläviä soluja yksityiskohtaisesti ilman fluoresoivia merkintöjä.

Solujen näkeminen ilman merkintöjä

Vuosikymmeniä fluoresenssimikroskopia on ollut solubiologian työkalu numero yksi. Merkitse proteiini, seuraa sen liikettä. Vaihtokauppa on ilmeinen. Merkinnät antavat spesifisyyttä, mutta ne myös rajoittavat, mitä voi nähdä kerralla ja kuinka kauan havainnointia voi jatkaa. Fluoresoivat väriaineet haalistuvat. Geneettiset tunnisteet voivat muuttaa kohteen käyttäytymistä. Entä jos voisi tarkkailla lukuisia rakenteita samanaikaisesti ilman, että soluun lisätään mitään?

Tähän tulee Interferometrinen kuvanhankinnan skannausmikroskopia, eli iISM. Menetelmä tallentaa solukomponenttien luonnollisen hajonnan ja voimistaa heikon valon interferometrian ja moni-elementtisen detektorin avulla. Tuloksena on merkitsemätön kuva, joka saavuttaa noin 120 nanometrin resoluution, skaalan jossa kalvon alatoimialueet, pienet organellit ja suuret proteiinikompleksit näkyvät luonnollisessa kontekstissaan. Tällainen selkeys on aiemmin vaatinut fluoresenssia tai hyvin erikoistuneita instrumentteja.

Työtä johtivat W.E. Moerner, nobel-palkittu superresoluutiofluoresenssimenetelmien kehittäjä, ja tohtorikoulutettava Michelle Kueppers. He esittelevät työn Light: Science and Applications -lehdessä. He eivät yllytä ylivertaisuudesta. iISM on täydentävä menetelmä. Se ei pyri korvaamaan fluoresenssia, vaan tarjoaa toisenlaisen vahvuusjoukon: laajemman kontekstin, pidemmän seurantakeston ja hellävaraisemman valaisun.

Michelle Kueppers ja W.E. Moerner.

Kuinka iISM yhdistää kahta traditiota

Perusperiaatteeltaan iISM yhdistää interferometristä hajontamikroskopiaa ja mukautettua kuvausskannausta kamera-alueilla. Molemmat osat ovat vakiintuneita, mutta yhdessä ne tuottavat jotain uutta.

Interferometrinen hajonta perustuu yksinkertaiseen fysikaaliseen seikkaan. Kun valo kohtaa pienen kohteen, osa siitä hajoaa eli siroutuu. Tämä sirontavalo kantaa tietoa kohteesta, mutta on usein hyvin heikkoa. Interferometria vahvistaa mitattavaa signaalia sekoittamalla sironneen aallon referenssiaallon kanssa, jolloin pienet vaihe- ja amplitudieroavaisuudet muuttuvat havaittaviksi vaihteluiksi. Tämä muistuttaa radiovastaanottimien signaalien yhdistelemistä herkkyyden parantamiseksi.

Tavalliset konfokaalimikroskoopit poistavat epätarkennettua valoa aukon avulla ja keräävät fotoneja yhdellä detektorilla. Modernit kuvausskannausmenetelmät korvaavat yhden detektorin pikselialueella. Jokainen pikseli saa hieman eri näkökulman samaan pieneen tilavuuteen. Useiden näkökulmien avulla voidaan laskennallisesti rekonstruoida terävämpi kuva. Ajattele sitä kymmenien tai satojen silmien joukona saman kohtauksen sijaan.

Stanfordin ryhmä rakensi alue-detektorin, joka kerää enemmän valoa kuin perinteinen aukko, ja kehitti prosessin näiden perspektiivien yhdistämiseen. Lopputulos on merkitsemätön kuva, jossa kontrasti on parantunut ja akseelinen tarkkuus kohentunut. Merkittävää on, että iISM saavuttaa tämän käyttäen pienempää valotehoa verrattuna muihin korkean kontrastin merkitsemättömiin menetelmiin. Pienempi teho tarkoittaa vähemmän valovauriota ja pidempiä havainnointijaksoja eläville soluille.

Tämä yhdistelmä avaa ikkunoita dynamiikkaan, jota on vaikea seurata fluoresenssilla. Tutkijat voivat seurata samanaikaisesti useita merkitsemättömiä kohteita ja tarkkailla niiden vasteita ärsykkeisiin kuten patogeeneihin tai lääkkeisiin. Koska merkintöjä ei lisätä, rakenteet näkyvät luonnollisessa tilassaan.

Sovellukset, yhteistyöt ja lähiajan näkymät

iISM:n välitön vetovoima on laaja. Moerner ja Kueppers hyödyntävät laitetta jo yhteistyöprojekteissa Stanfordin eri ryhmien kanssa. Yksi tiimi tarkkailee kasvin solujen, sienten ja bakteerien vuorovaikutuksia reaaliajassa. Toinen seuraa syöpälääkkeen sisääntuloreittiä soluihin. Kolmas aikoo tallentaa, miten punasolut muokkautuvat malariainfektion aikana. Nämä ovat käytännönläheisiä ja vaikutuksellisia kysymyksiä, joissa merkitsemättömyyden tuoma konteksti on tärkeä.

Varhaisten projektien lisäksi menetelmä voi vaikuttaa useisiin elämän­tieteiden aloihin. Patogeenien soluun pääsyn tutkiminen, kalvon uudelleenmuotoituminen, solunsisäinen kuljetus ja lääkkeiden otto voisivat hyötyä. Lääkekehityksessä iISM voisi paljastaa, miten kandidaattimolekyyli kulkee solurajapintojen läpi ilman fluoresenssitunnisteiden häiritseviä vaikutuksia. Kasvitieteessä se voi näyttää monisoluisia vuorovaikutuksia isännän ja mikrobin rajapinnassa.

On olemassa kompromisseja. iISM ei vielä saavuta samaa molekyyli­spesifisyyttä, jonka kohdennettu fluoresenssi tarjoaa. Se ei yksin tunnista yksittäistä proteiinia tuhansien joukosta. Kueppers ja Moerner kuitenkin näkevät hybriditulevaisuuden, jossa fluoresenssi tarjoaa molekyyli-identiteetin ja iISM antaa merkitsemättömän kontekstin ja laajemman dynaamisen alueen. Yhdessä nuo näkymät antaisivat tutkijoille sekä sen kuka että sen miten.

Asiantuntijan näkemys

«Tämä on pragmaattinen edistysaskel», sanoo tohtori Elena Park, solukuvantamisen asiantuntija tutkimuslaitoksesta, joka ei ole mukana työssä. «Tärkeää ei ole pelkästään resoluutio, vaan kyky seurata prosesseja niiden tapahtumahetkellä ilman, että niitä häiritään. iISM vähentää tarkkailijan vaikutusta. Se voi muuttaa kokeellista suunnittelua ja avata kysymyksiä, joita emme aiemmin osanneet muotoilla.»

Tohtori Park lisää varoituksen: «Käytön laajentuminen riippuu helppokäyttöisyydestä ja saatavuudesta. Jos teknologia muuttuu useampien laboratorioden saatavaksi, se nopeuttaa löytöjä. Jos se pysyy harvinaisena ratkaisuna, eteneminen on hitaampaa.»

Moerner ja Kueppers näyttävät käsittelevän tätä kynnystä. He kehittävät laitetta eteenpäin ja hakevat yhteistyöprojekteja, jotka demonstroivat menetelmää erilaisissa biologisissa järjestelmissä. Tällainen ulottuvuus on tärkeä, jotta yksittäisen laboratorion innovation voi siirtyä laajemman yhteisön työkaluksi.

Käytännön hyödyt ovat selkeät. Alhaisempi fototoksisuus, pidennetty elävän näytteen kuvantaminen, useiden merkitsemättömien rakenteiden samanaikainen visualisointi ja yhteensopivuus nopeiden dynamiikkojen kanssa muodostavat hyödyllisen ominaisuusjoukon moniin kokeisiin. Kysymyksissä, joissa molekyylispesifisyys on välttämätön, fluoresenssi on edelleen korvaamaton. Kysymyksissä, joissa tarvitaan kontekstia ja hellävaraista havainnointia, iISM on lupaava.

Lyhyesti, iISM lisää käytännöllisen linssin mikroskopian työkalupakkiin. Se suosii hienovaraisuutta näyttämisen sijaan. Se paljastaa liikkeen in situ, ilman että solu maalataan fluoresoivilla väreillä. Tutkijoille, jotka haluavat katsoa elämän tapahtuvan sen sijaan, että merkitsisivät sitä, tämä on merkittävä askel eteenpäin.